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本文中搭建的实验装置与传统生物散斑测量装置类似,如图 1所示。光束由激光二极管(Osram, PLT5 520)发出,波长为520 nm,功率为50 mW,经过准直后出射。准直光约以45°角倾斜照明样品,并被样品中颗粒散射,散射光进入可调倍率工业显微镜头后成像,实验中使用倍率为0.75×,并由工业相机(Mightex,SME-C050-U)成像,像素尺寸为2.4 μm×2.4 μm,曝光时间及增益可手动调节,图像像素数目为2560 pixel× 1920 pixel。相机及镜头安装在平移台上,可上下移动调节成像系统位置。
实验测量了市场购买的中药糖浆(京都念慈庵蜜炼川贝枇杷膏)、老酸奶(君乐宝低温原味)、酸奶(安慕希原味)、西红柿、苹果等样品的散斑图像,典型散斑图像如图 2a所示。由于散斑图像的形成具有随机性,直接观察图像判断散斑工作量较大,使用图像处理算法表征散斑活性必不可少。图 2b为去背景的散斑图像。
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动态光散射及荧光相关光谱技术中使用雪崩二极管或光电倍增管等点探测器测量微观聚焦照明区域内散射光及荧光的时域信号,信号的时间相关性定义为相关系数[22-23]。由于照明区域内颗粒数目有限,颗粒进入及离开照明区域时会引起散射光及荧光强度的变化,变化持续的时间与颗粒运动速率密切相关,因此相关系数反映了颗粒运动的速率。荧光相关光谱技术测量的典型单分散颗粒群相关系数曲线如图 3所示。可见相关系数随着时间间隔增大迅速降低,且下降速度与颗粒运动速率有关。
由于生物散斑技术中照明区域较大,现有以聚焦区域内强度涨落为基础的相关系数定义[23]已不再适用,因此本文中对相关系数C0(Δt)进行了改进,如下式所示:
$ \begin{gathered} & C_0(\Delta t)= \\ & \frac{\sum\limits_{i=1}^h \sum\limits_{j=1}^w I(i, j, n) I(i, j, n+\Delta n)}{\sqrt{\sum\limits_{i=1}^h \sum\limits_{j=1}^w I^2(i, j, n)} \sqrt{\sum\limits_{i=1}^h \sum\limits_{j=1}^w I^2(i, j, n+\Delta n)}} \end{gathered} $
(1) 式中:I(i, j, n)为第n帧图像i行j列的像素值;Δt为两幅图像的时间间隔;Δn为两幅图像的帧数间隔;h及w分别为感兴趣区域的行数及列数。式(1)为不同时刻图像之间的空间相关性,改进后的相关系数引入了散斑图像的统计信息,能够准确全面反映感兴趣区域内散斑图像的变化情况。当第n帧及第n+Δn帧散斑图像完全相同时,C0(Δt)取得最大值1,随着时间间隔增加,散斑位置及强度逐渐变化,C0(Δt)值减小,观察曲线,近似可用下式描述:
$ C_0(\Delta t)=1-c_0+c_0 \exp \left(-\Delta t / \tau_0\right) $
(2) 式中:c0是自定义常数,与散斑图像背景强度有关;τ0为相关系数衰减时间;Δt足够大时,C0(Δt)逼近稳定值1-c0;τ0与颗粒速率密切相关,颗粒运动速率越快,其对应值越小。通过测量样品τ0即可表征颗粒群分布或运动速率是否发生变化,进而判断样品是否发生变化。
受到杂散光影响,散斑图像一般具有较强背景,导致相关系数衰减不够明显。为便于观察,增大曲线对比度,本文作者在式(1)基础上进行了改进,突出了高频细节的影响,改进后的相关系数为:
$ \begin{gathered} C_1(\Delta t)= \\ \frac{\sum\limits_{i=1}^h \sum\limits_{j=1}^w I_1(i, j, n) I_1(i, j, n+\Delta n)}{\sqrt{\sum\limits_{i=1}^h \sum\limits_{j=1}^w I_1{ }^2(i, j, n)} \sqrt{\sum\limits_{i=1}^h \sum\limits_{j=1}^w I_1{ }^2(i, j, n+\Delta n)}} \end{gathered} $
(3) $ I_1(i, j, n)=I(i, j, n)-I_0(i, j, n) $
(4) 式中:I0(i, j, n)为使用像素点(i, j)邻域窗口(宽为w0,高为h0)内像素值均值滤波的结果,近似为图像背景,因此I1(i, j, n)可认为是保留了散斑图像中高频部分。如图 2b所示,当散斑变化时,改进后的相关系数C1(Δt)变化更大,能够更准确反映颗粒的移动。
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基于上述实验装置及处理算法,本文中开展了实验研究,实验地点为南京,测试了改进后相关系数的性能。实验中设置相机帧频为每秒18帧,连续采集8 s,在硬盘中保存图像便于后续处理。实验前使用白光照明,根据预览图像调整镜头与样品的相对位置,使得样品表面处成像较为清晰。由于散斑测量的结果一般较易受到实验及图像参数的影响,本文作者分别对相机曝光时间、散斑区域尺寸及均值滤波窗口尺寸进行了测试,确保不同参数下测量结果具有良好的一致性,方便实际应用。由于散斑方法主要表征颗粒的运动,而几种样品中中药糖浆的质地最为均匀,因此本文中首先使用中药糖浆进行了测试。实验时吸取约2 mL糖浆放置于透明载波片上暴露在空气中。由于糖浆较为粘稠,长时间放置后仍保持液体状态边缘处有较大曲率,可能导致镜面反射,实验中需移动样品位置,避免边缘处位于成像视场内。
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曝光时间对图像的绝对强度影响较大,过曝光及欠曝光均可能导致散斑活性指标计算发生较大偏差。不失一般性,本文中分别将相机曝光时间T设置为10 ms及50 ms,观察图像没有明显的过曝光及欠曝光情况。基于式(1)及式(3)计算了未消除背景及消除背景后不同时间间隔时相关系数的曲线,结果如图 4所示。根据相关系数定义可知,Δt=0时相关系数始终为1,无需处理,其天然具有最大值归一化的效果,其下降速度与散斑图像变化速度有关。图 4a中当曝光时间变化时曲线稳态值显著不同,表明未消除背景时相关系数的最小值没有归一化的效果,这主要是因为曝光时间较大时,图像背景强度明显偏大,即使颗粒移动导致散斑光点发生移动,相关系数值仍然较大。尽管可使用式(2)拟合曲线确定c0及τ0等参数,但实际拟合时由于式(2)使用的指数衰减模型与实际测量数据存在一定偏差,拟合误差可能较大。对于指数下降曲线,可定义曲线值下降到一定值对应的时间为特征时间表征下降速度,但由于相关系数值始终缓慢降低,最小值难以确定,因此该方法难以应用。与图 4a不同,经过消除背景(均值滤波窗口为矩形窗口,面积S=11 pixel×11 pixel)后,图 4b中相关系数曲线的最大值和最小值均表现出归一化的特性,即最大值1对应于Δt=0,最小值0对应于无穷远时刻,无需任何特别处理,因此不失一般性,可定义当相关系数下降至0.707时对应的延迟时间为特征时间,记为T0。对比不同曝光时间的曲线可见,T0均为0.22 s,与曝光时间设置几乎无关,这主要是因为T0远大于相机曝光时间,在相机曝光过程中,颗粒位移较小,不影响测量。与拟合法相比,使用特征时间的另一优势为具有较高的效率。拟合法需采集整个时间段内的图像,耗时数秒以上(本文中为8 s),而T0只需采集0.3 s内图像。由于散斑测量对振动噪声更为敏感,长时间测量可能引入较多的噪声干扰,缩短测量时间将显著提高抗干扰能力。另一方面,当颗粒种类及速度分布多样时,曲线下降趋势复杂,因此观察曲线的下降趋势同样可揭示颗粒运动的信息。
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由于T0为整幅图像的统计指标,若对散斑计算区域具有依赖性,则难以在实际应用中使用。本文中测试了散斑计算区域对T0的影响,将图 2a散斑图像等分为1~4共4个区域,分别计算每个区域的相关系数曲线,结果如图 5所示。4个区域的曲线在Δt较大时的稳态值存在一定差异,而在较小处几乎重合。由于T0只需相关系数下降至0.707即可,无需稳态处取值,因此稳态处差异并不影响特征时间的计算。
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去除散斑图像背景的核心是均值滤波,滤波窗口尺寸变化时可能导致曲线的趋势发生变化,本文中计算了窗口的影响,结果如图 6所示。窗口尺寸w0×h0从5 pixel×5 pixel增加至101 pixel×101 pixel时相关系数变化趋势几乎不变,且在特征时间内曲线几乎重合,长时间后稳态值则稍有区别,这主要是因为窗口尺寸较大时,背景难以反映局部变化,导致减去平滑图像后局部仍存在一定的非零背景。由于T0几乎不受曝光时间、散斑位置等实验参数影响,可视为样品的一个客观物理量。
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为进一步定性表征特征时间T0及颗粒运动速率之间的关系,本文中将糖浆样品放置于1维电动平移台(派迪威,PP110-50)上,使用运动控制卡及闭环步进电机驱动平移台以恒定速率v匀速运动,测量T0随平移台运动速率v的变化,每组速率均重复5次,结果如图 7所示。当v较小时,样品内颗粒的平均速率与v一致,但由于颗粒自身布朗运动的影响不可忽略,T0与图 4b中数值相差不大。随着v增加,颗粒定向运动的影响逐渐超越布朗运动,T0逐渐减小,且与v近似成反比,表明T0与v之间存在一定的对应关系。
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Fujii指标具有计算效率高、物理意义明确的特点,在生物散斑图像处理中获得广泛应用,定义式为:
$ F(i, j, N)=\sum\limits_{n=1}^{N-1} \frac{|I(i, j, n)-I(i, j, n+1)|}{|I(i, j, n)+I(i, j, n+1)|} $
(5) 式中:N为散斑图像总帧数。可见Fujii指标直接计算连续两张图像像素值的差,能够直观反映强度的变化。本文作者进一步测试了Fujii指标的效果,验证Fujii指标是否存在类似特征参数。由于糖浆样品各处颗粒运动的速率应近似相同,本文作者模仿相关系数的处理方法绘制了不同曝光时间时感兴趣区域内Fujii指标的平均值随时间间隔的变化关系,结果如图 8a所示,Fujii指标在短时间内快速上升后逐渐趋向于稳定值。受到曝光时间变化的影响,背景光强发生了较大的变化,使得两种曝光时间对应的稳态值不同,10 ms时的稳态值略大于50 ms时的稳态值。为构造特征参数,使用稳态时的最大值对Fujii指标进行了归一化处理,结果如图 8b所示。尽管稳态时的曲线几乎重合,但快速上升期的曲线差异较大,曝光时间10 ms对应的曲线上升速率远大于50 ms对应的曲线,意味着难以确定一个只与样品性质有关的特征参数。上述结果表明,与Fujii指标相比,相关系数随时间的变化关系能更有效表征颗粒扩散的速率。
基于相关系数的生物散斑活性表征研究
Characterization of biospeckle activity based on correlation coefficient
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摘要: 为了解决传统生物散斑测量结果易受实验参数影响的问题,采用模拟动态光散射及荧光相关光谱技术,用相关系数表征生物散斑活性,搭建了实验装置,并对中药糖浆、酸奶、老酸奶、西红柿、苹果等产品进行了实验测试。结果表明,基于相关系数构造的特征时间指标主要由样品中颗粒运动的速率决定,物理意义明确,几乎不受相机曝光时间、散斑区域等实验参数的影响,平均测量偏差小于5%,易在实际应用中使用。由于农业及医药领域中生物样品的多种特性均与颗粒运动速度有关,该方法可为食品、药品行业提供一种新的无损检测工具。Abstract: The measurement of traditional laser biospeckle is significantly affected by experimental parameters. To address this problem, dynamic light scattering and fluorescence correlation spectroscopy were used to characterize the biospeckle activity. An experimental setup was built and tested with traditional Chinese medicine syrup, yogurt, old yogurt, tomatoes, and apples. The results show that the constructed metric based on the correlation coefficient with a clear physical meaning is mainly determined by the speed of particle movement in the sample, which has an average error less than 5%. As the metric is almost independent of the exposure time of camera and region of interest, it is beneficial for the biospeckle technology to be used in practical applications. Since various characteristics of biological samples in the agricultural and pharmaceutical fields are related to the speed of particle movement, this method is expected to provide a new non-destructive testing tool for food and pharmaceutical industries.
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