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亚胺硫磷是一种日常生活中常见的有机磷农药，是目前农业生产中控制病虫害的主要药物。在水稻、果树、蔬菜、棉花的农业种植和生产中亚胺硫磷农药使用普遍，但它对生物体有毒性，可引发动物体神经性中毒，使人体神经系统瘫痪。化学名称为二甲基邻苯二甲酰亚胺基甲基二硫代磷酸酯，白色晶体纯品，溶解后有刺激性气味, 碱、乙醇、苯、四氯化碳、丙酮等皆能作为溶剂，微溶于水，分子式为C11H12NO4PS2，分子结构较为复杂。亚胺硫磷能侵入植被叶面蜡质层，残留量较大，残留药效期长，对亚胺硫磷残留的定性研究具有重要意义。当前，检测亚胺硫磷残留的主要方法为气相色谱法、高效液相色谱法、免疫分析法等。
喇曼光谱技术具有无需样品制备、不产生损伤以及得到的信息丰富、灵敏度和选择性高的优点，被广泛应用于食品安全领域，它是一种以分析、测试被测试物质分子结构的无损智能检测技术。但由于喇曼散射面积小、喇曼效应弱、灵敏度低，对样品的分析有很大的局限性[1]。表面增强喇曼光谱技术(surface enhanced Raman spectroscopy, SERS)集灵敏度、分辨率、稳定性和抗水干扰性等优点于一体，成为检测各种物质分子间的相互作用、分子结构、分子吸附行为的工具。常用的SERS活性基底的制备方法有电化学氧化还原法、金属溶胶法、化学组装法、金属/氧化物核壳法等。因团絮状灰褐色银胶粒子对喇曼光谱具有很强的表面增强效应，以银胶为代表的金属溶胶法是目前常用的表面增强活性基底制备方法。
据近些年的文献记载，SERS技术被广泛用于微量有害物质快速检测、环境污染物检测、食品痕量化学危害检测以及农药残留检测。在水果农药残留检测方面，WEN等人[2]研究了基于银纳米表面增强喇曼光谱快速检测水果中有机硫农药残留。WENG[3]做了基于光谱吸收-表面增强喇曼光谱的有机磷农药残留快速分析检测研究。针对脐橙，WANG等人[4]进行了表面增强喇曼光谱法快速检测脐橙果肉中三唑磷农药残留的研究，而对亚胺硫磷这种有机磷农药的残留研究得较少。
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采用德国布鲁克公司生产的共聚焦激光显微喇曼光谱仪，型号为SENTERRA，光谱检测波长范围是90cm-1~3500cm-1，仪器配备有Olympus BX11光学显微镜，波数精度达0.5cm-1，具备在线实时校正功能。仪器上的检测器、光栅和滤光片可实现自动定位，光谱仪与电脑相连接，电脑装有OPUS(verion6.1; Bruker Optik GmbH, Germany)光谱采集配套软件。实验中采集的光谱数据用化学计量学软件Unscrambler V10.1和V8.0(CAMO AS，Trondheim，Norway)导入，并建立数学模型进行分析。振荡仪为江苏其林贝尔仪器制造有限公司的MH-2型微量振荡器，振荡摇匀混合液体样本时速度调到中等速度。移液器来自上海康敏检验设备公司，实验中用到100μL~1000μL的规格型号。
选择赣南脐橙为实验对象，以亚胺硫磷残留为指标进行分析。从北京伟业科创有限公司购买了纯品亚胺硫磷标准样品。实验中清洗用水和溶剂水均为超纯水，采用东莞陶氏水处理设备公司的实验室超纯水机，利用反渗透工艺制备超纯水，制水的电阻率为17.9MΩ/cm。
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首先配制1mg/L~35mg/L浓度梯度为1mg/L的35个亚胺硫磷溶液，过程模拟实际中脐橙表皮的农药残留。具体步骤如下：(1)正常的脐橙表皮，用超纯水洗净并自然风干，然后切成4cm2面积大小的正方形小块; (2)配备2000mg/L的亚胺硫磷标准溶液，分别滴加0.6mL标准溶液到每一小片脐橙表皮上，晾干后，剪碎脐橙表皮并加入8mL乙腈溶液，目的是萃取滴加到表皮上的农药; (3)搅拌震荡后过滤，用甲醇冲洗过滤后的表皮并收集滤液，再以甲醇和超纯水(体积比为1:1)混合溶液作为溶剂，定容至20mL, 得到60mg/L的亚胺硫磷溶液; (4)以60mg/L的亚胺硫磷溶液为母液，按同样的定容方法分别配制1mg/L~35mg/L的35种不同浓度的农药溶液样品, 保存于褐色容量瓶中，其相邻浓度之间的浓度差(梯度)为1mg/L。然后用还原柠檬酸钠法，通过加热煮沸硝酸银和柠檬酸钠溶液制得银胶，制得的银溶胶颜色呈黄绿色，避光保存。
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用移液器取800μL超纯水与100μL银胶混合，然后振荡直至混合均匀。取50μL混合液体滴于干净的石英玻璃片上，采集得到用超纯水做空白对照的银胶SERS光谱图。从图 1可知，对照中没有出现明显的喇曼峰，更没有特征峰，说明所制银胶对农药样品的SERS信号采集不会有特征峰干扰影响。
Figure 1. SERS spectrum of silver colloid
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分别取不同浓度的亚胺硫磷溶液样品800μL、银胶100μL于1.5mL试剂管中，在振荡仪上振荡3min，使混合溶液充分均匀，用移液器吸取50μL混合溶液滴到干净的石英玻璃片上，每种浓度取5次，小心放置于载物台，打开电脑上的OPUS光谱采集软件开始采集光谱，激光波长选781nm，激光功率10mW，分辨率9cm-1~11cm-1；积分时间10s，叠加1次；放大倍数选择20×，光斑直径10μm~1000μm。每个浓度的实验样品的每次取样均测试不同的5点，对每取一次样品溶液采集到的5条原始喇曼光谱，用OPUS软件得出平均光谱，一共有35×5个平均光谱，把这175个平均光谱数据导入Unscrambler X 10.1软件，建立数学模型进行定量分析。
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为判断银胶对亚胺硫磷SERS增强的效果，首先采集纯品亚胺硫磷固体，喇曼光谱如图 2所示。查阅参考文献[6]，亚胺硫磷605cm-1 , 650cm-1 , 1016cm-1和1454cm-1处的特征峰，谱带分别归属于环变形、P==S伸缩振动、骨架伸缩和O==C—N伸缩。
Figure 2. Raman spectrum of phosmet powder
实验中总共采集了175条SERS喇曼光谱，由于喇曼光谱仪信噪比低，以及采集时的干扰，造成9条异常光谱，将其剔除，剩余166条光谱如图 3所示。将图 3与图 2对比，SERS光谱的特征峰有明显的增强，605cm-1, 1016cm-1, 1454cm-1位置的峰位得到增强。与此同时，图中光谱大部分都不是重合的，只从喇曼光谱图的形态上观察，随着溶液中亚胺硫磷浓度的增加，特征峰强度随着增强。除信号强度存在差异，特征峰峰形和峰位基本保持一致。峰位发生一定程度的偏移，605cm-1位置的峰红移到618cm-1，1016cm-1峰蓝移到1015cm-1，1454cm-1位置的峰蓝移到1449cm-1。图中800cm-1附近的峰以及其它峰为甲醇和乙腈等其它物质的特征峰，无需分析，在数据处理时运用不同预处理方法减小其干扰和影响。
Figure 3. Raman spectra of the mixed sample of phosmet and silver colloid
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检出限是评价一种分析方法优劣的一个重要指标，它可以通过特定的方法，在一定的水平内计算出待测物的最小浓度或最小含量[7]。作者采用留一交互验证法[8]建立偏最小二乘法(partial least square, PLS)定量模型，参与建模的样品选取10mg/L~19mg/L的10个浓度样品，如图 4所示。由下式在一定置信区间内计算出亚胺硫磷的检出限值:
Figure 4. Cross-validation of mixed samples of phosmet
$\mathit{D = }{\rm{3}}\mathit{\sigma /k} $
(1) 式中, σ为预测浓度的标准误差，k为校准线的斜率数值。计算得出，亚胺硫磷混合溶液的检出限值为4.113mg/L。
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虽然喇曼光谱在检测上有众多优点，但由于原始光谱信号受发射噪声、荧光等方面因素的影响，干扰较大。为了最大消除噪声、荧光和其它背景的干扰以及减小甲醇和乙腈等无关物质的特征峰的干扰，提高样品化学成分数学模型的预测能力和稳定性，通常采用卷积平滑、基线校正、1阶导数、2阶导数等不同光谱预处理方法。卷积平滑通过去除信号中的高频来达到改善信号信噪比的目的，基线校正法能有效地扣除荧光背景和消除光谱仪器造成的影响，最大程度地保留样品有用的光谱信息。1阶导法和2阶导法能有效地消除基线等外部干扰，但会导致信噪比增大[9]。预处理后，结合PLS建立定量分析模型，从中筛选出最优的光谱预处理方法。比较PLS建模算法建立的喇曼光谱与农药含量之间的预测模型，并对模型的预测效果进行评价分析。
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以166个亚胺硫磷SERS光谱数据和35个浓度真值作为输入，研究618cm-1，1015cm-1，1449cm-1处的特征峰并进行农药残留的定量研究。用化学计量学方法处理光谱数据，采用不同种的预处理结合PLS建立的定量分析模型。按照3:1比例划分，166个光谱数据分为103个校正集，63个预测集，由软件自动随机分配形成。并通过比较校正集与预测集的相关系数Rc和Rp以及校正集与预测集的均方根误差Sc和Sp来评价模型，相关系数和均方根误差最接近，且相关系数越高，均方根误差越小，则建模效果最好，为最优预处理方法。如表 1所示，7种不同的预处理方法结合PLS建立定量模型数据，经过对比可得，基线校正和卷积平滑方法预处理后建立的数学模型的效果最佳。此时预测集的相关系数Rp=0.904，Sp=4.890mg/L，小于检出限值4.113mg/L, 预测集的PLS模型拟合曲线如图 5所示。
Figure 5. Relationship between the predicted value and the reference values of phosmet optimal model
Table 1. PLS comparison after different pretreatment of phosmet
pretreatment method factor calibration value predicten value Rc Sc/
(mg·L-1)Rp Sp/
(mg·L-1)original 10 0.921 3.931 0.898 5.115 1st derivarive 7 0.922 3.916 0.824 6.331 2nd derivarive 6 0.942 3.391 0.764 6.994 savitzky-golay smoothing 10 0.919 3.976 0.899 5.102 baseline 10 0.920 3.954 0.902 4.910 baseline+ savitzkygolay smoothing 10 0.919 3.990 0.904 4.890 baseline+2nd derivarive 6 0.940 3.448 0.763 7.019 savitzky-golay smoothing+2nd derivarive 6 0.880 4.808 0.829 6.117 在校正集样品数为103个不变的情况下，PLS建立的模型与主因子数的选取有关，直接关系到模型的实际预测能力。模型建立过程中进行了最佳主因子数的合理选择，避免了主因子数过少产生建模信息残缺的不良结果，同时也防止了主因子数过大而使得模型太复杂，甚至出现过拟合的实验缺陷。本文中采取光谱数据PLS交叉验证法选取最佳主因子数，见图 6。如图 6所示，当主因子数为10时，均方根误差最小，即为最好预测模型。
Figure 6. Determination of optimal principal factors of phosmet PLS model
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实验中分别采集了亚胺硫磷农药的固体样本光谱、标准溶液样品光谱混合银胶后的激光吸收峰[10]表面增强光谱。比较混合溶液样品光谱与固体样本光谱得出：银胶对亚胺硫磷的特征峰有很好的增强效果，并且随着溶液中农药含量的增加，其相应的特征谱峰强度也增加。除信号强度存在差异，其增强的峰形和峰位基本保持一致，确定亚胺硫磷SERS样品主要特征峰增强位于605cm-1，1016cm-1，1454cm-1，同时在其它物质的混合影响下，峰位发生一定程度的偏移。交叉验证法结合公式得出农药检出限值为4.113mg/L，对采集的168个混合样品光谱数据进行不同方法预处理，结果显示，采用先基线后平滑的预处理方法结合PLS算法建立的模型预测效果最好，Sc=3.990mg/L，Rc=0.919，Rp=0.904，Sp=4.890mg/L，小于亚胺硫磷的检出限，说明该方法可行。作者证明了SERS定量分析的科学性，对国内水果的工业生产和出口农药残留检测有一定的借鉴作用。
实验中有不足之处，导致Sp偏大，经过讨论分析，估计是由于农药样品采集的光谱数量多，采集的光谱受到外界环境和检测时人工误差的影响。通过改进喇曼光谱采集方法，来增强实验设备的可靠性，以提高可重复性、减小误差。
表面增强喇曼光谱研究脐橙中亚胺硫磷农药残留
Quantitative study on phosmet residues in navel oranges based on surface enhanced Raman spectra
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摘要: 为了证实以团絮状银胶为基底的表面增强喇曼光谱（SERS）技术结合化学计量学方法能有效实现脐橙中农药残留检测，采用德国布鲁克公司的共焦显微喇曼光谱仪，对脐橙中的亚胺硫磷农药残留的快速无损检测进行了研究。通过留一交互验证法得出农药检出限为4.113mg/L，并对SERS光谱进行7种方法的预处理。结果表明，先基线校正后卷积平滑预处理的建模预测效果最好；结合偏最小二乘法建模，预测集的相关系数和预测均方根误差分别为0.904和4.890mg/L，校正集的相关系数和预测均方根误差分别为0.919和3.990mg/L。结果证明了SERS定量分析的科学性和可行性，这对国内水果的生产和出口水果的农药残留检测有一定的参考作用。Abstract: In order to confirm that surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) with flocculent colloid as substrate, combined with chemometric methods, can effectively detect pesticide residues in oranges, rapid and nondestructive detection of phosmet pesticide residues in navel oranges was studied with the help of confocal laser Raman spectrometer of Germany Bruker Optik GmbH. Detection limit of 4.113mg/L was concluded by cross validation method, and 7 methods of pretreatment of SERS spectra were carried out. After comparison, pretreatment method is the best with baseline correction at first, and then convolution smoothing, combined with partial least squares modeling. Correlation coefficient of prediction set is 0.904 and root mean square error of prediction set is 4.890mg/L. Correlation coefficient of correction set is 0.919 and root mean square error of correction set is 3.990mg/L. The results prove that the scientificity and feasibility of quantitative analysis of SERS. The study has certain reference in pesticide residue detection of export fruit and industrial production of domestic fruit.
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Figure 5. Relationship between the predicted value and the reference values of phosmet optimal model
Table 1. PLS comparison after different pretreatment of phosmet
pretreatment method factor calibration value predicten value Rc Sc/
(mg·L-1)Rp Sp/
(mg·L-1)original 10 0.921 3.931 0.898 5.115 1st derivarive 7 0.922 3.916 0.824 6.331 2nd derivarive 6 0.942 3.391 0.764 6.994 savitzky-golay smoothing 10 0.919 3.976 0.899 5.102 baseline 10 0.920 3.954 0.902 4.910 baseline+ savitzkygolay smoothing 10 0.919 3.990 0.904 4.890 baseline+2nd derivarive 6 0.940 3.448 0.763 7.019 savitzky-golay smoothing+2nd derivarive 6 0.880 4.808 0.829 6.117 
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图(6) / 表(1)
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