Application research of fluorescence suppression based on differential Raman technique

印度科学家喇曼在1928年，首次在水银灯照射苯液体的实验中发现了一个新的辐射谱线，并以自己的名字将其命名为喇曼光谱^[1-4]。喇曼光谱作为一种分子“指纹”图谱，是根据物质分子间的振动，从而识别出未知物^[5]。然而在实际检测应用中，喇曼光谱的有效信号往往会被淹没在荧光背景中难以识别。为了消除荧光背景提出了许多方法。一种简单的方法就是加入荧光猝灭剂^[6]。但是使用这种方法的时候必须要保证样品不会受到高浓度的荧光猝灭剂干扰，对于生物样品来说，这基本不可能。另一种方法就是傅里叶变换(Fourier transform，FT)喇曼光谱，但是这种方法也有着一些严重的缺陷。首先，这种激发光不会直接与任何的基团发生共振，在多组分样本中就不能实现对特定基团的选择性增强。其次，由于激发光受限于预激发波长，就不能通过吸收带来测量共振喇曼激发的轮廓曲线(喇曼强度是激发波长的函数)^[7-9]。

虽然上述的荧光消除技术已经发挥了一些用处，但是它们的适用性还是有一定的限制。1992年，由美国加州大学伯克利分校化学系MATHIES等人最早提出了位移差分喇曼的方法^[10]，通过物理和数学相结合差分喇曼技术可以准确、有效地消除荧光背景，得到物质的有效特征喇曼谱图。Ferdinand Braun研究所的研究人员在瑞士的一个苹果园采用位移激发差分喇曼技术，克服室外背景阳光以及样品荧光干扰，对苹果皮和苹果树叶进行了位移激发差分喇曼技术(shifted excitation Raman difference spectroscopy, SERDS)测量，获得了苹果的指纹特征^[11]。该团队还基于差分喇曼技术进行了针对人体健康的人体皮肤中胡萝卜素的检测研究，实现了标准样品0.05nmol/g的检出限。美国和克罗地亚研究人员通过位移激发差分喇曼技术在谱图中恢复了葡萄酒中乙醇和甲醇的光谱，最终通过400次平均最终实现对含量在0.05%甲醇的检测。

作者所在团队将差分喇曼技术和误差反向传播(back propagation, BP)神经网络算法相结合，可以准确、有效地分离差分信号和基线偏差，再运用团队开发的差分喇曼解调和去噪算法，可以得到有效的物质喇曼特征谱图，能够很好地解决目前行业应用中检测的难题。

根据卡莎规则^[12]，分子所发射的光(荧光或磷光)只能从某一多重态中的最低态激发，因此对于激发光的微小偏移并不影响背景(样品受激发射光谱)。获得的喇曼光谱的荧光轮廓几乎不发生变化。而喇曼光谱作为散射光谱特征峰出现的位置与激发光源频谱位置有固定关系，当激发光频率移动时喇曼特征峰会跟着移动。JOHANNES用宽谱光源进行光谱成像，很形象地说明了这一现象^[13]。图 1a中x轴代表的是波长，颜色谱代表了接收到的光谱强度。可以看出, 中间有很强的一片区域是中心对称的，代表了不随激发光频率变化的受激发射光谱，而窄窄的倾斜光谱则是喇曼光谱。图 1b表示的两个邻近的激发波长λ₁，λ₂采集的喇曼光谱，可以从放大部分看出喇曼特征峰有微小偏移^[14]。

Figure 1.  Fluorescence and Raman spectra

图 2表示差分喇曼技术采用物理和数学相结合的荧光处理方法，是常规的流程^[15]。

Figure 2.  Fluorescence processing method by using physics and mathematics

首先，需要获得采用具有已知微小波长错位的光源激发的喇曼光谱，再通过归一化、重建以及基线矫正等，将光谱的基线对齐。理论上对齐后光谱相减生成的曲线中仅包含喇曼光谱的差分信息。根据下式^[16]：

式中, ν₁和ν₂分别表示两种激发光源的频率，ν代表绝对频率，S是绝对频率下的总的信号，f是通过用已知的真实光源的光谱除以测量光源的光谱计算出的形状因子，R代表的是喇曼光谱的强度，R(－ν)表示的是真实的喇曼位移谱的镜像。对于单色性比较好的激光束，激发光谱可以表示为狄拉克函数δ(ν-ν_i)。

可以将差分曲线看作喇曼光谱横轴颠倒后与两个δ函数差的卷积:

对差分曲线积分后，可以看作喇曼光谱与一个方波函数的卷积，通过解卷积的方式获得真实喇曼光谱, (2)式中Δν表示的是两种激发光源频率的差值的绝对值，(3)式中ν表示种激发光源频率的平均值。

但是，实际操作中虽然两次差分光谱虽然相差不大，但是由于激光的漂白作用或激光的波动，焦点位置的微小变化等各种因素都可能导致光谱曲线的变化^[17]。错误的对齐将在差分喇曼光谱重建过程中被放大，降低喇曼特征提取效果。虽然希望通过光谱对齐, 通过差分扣除光谱中的荧光部分，分离荧光和喇曼信号；但是只有知道准确的荧光才可能让光谱荧光完美地对齐^[18-20]。而如果已经可以清除地区分荧光和喇曼信号，则没有必要对光谱信号进行差分。为了解决这一问题，常规做法是近似，根据整个光谱面积或关键的局部面积作为基准对谱图进行缩放和平移，使谱图的匹配基本匹配。然后在对差分后产生的曲线进行矫正，如交替最小二乘法(alternating least squares, ALS)拟合^[21]。但是由于拟合目标是未知的，所以该方法还存在很多不确定性。

作者所在团队开发的BP神经网络技术，是通过迭代最优解的方式，将差分、对齐和基线矫正同时完成，可以准确分离差分信号和基线偏差，差分过程如图 3所示。图 3a中表示的是在处理差分图谱，最优迭代的过程。图 3b中表示的是通过作者所在团队开发的BP神经网络技术，经过几十次的迭代后, 损失函数(损失函数是一个非负实值函数，损失函数越小)可以降低到很低，可以有效地得到目标数值。

Figure 3.  Differential Process

再结合自主研发的中心波长为785nm、间距为1nm的差分喇曼系统、差分喇曼解调和去噪算法，分别对目前喇曼应用的行业(食品安全检测、公共安全检测等)中弱激发下的样品喇曼特征进行了研究。

图 4~图 6检测的样品分别为农药百草枯、补肾丸、机油。3幅图中几乎重叠在一起的两条谱线分别代表的是差分系统中两种激发波长下得到的喇曼原始谱图，另外一条有明显特征喇曼峰的谱图表示的是通过差分技术、BP神经网络技术以及去噪和解调算法等得到的有效特征谱图。

Figure 4.  Raman spectrogram of paraquat

Figure 5.  Raman spectrogram of kidney-tonifying pill

Figure 6.  Raman spectrogram of engine oil

中心波长为785nm的便携式喇曼在公共安全行业中的应用最典型的就是对毒品中的海洛因直接检测时，受激发射信号(荧光背景)较强，从而得不到有效的喇曼特征峰，无法进行辨别判定。图 7中几乎重叠在一起的两条谱线代表的是差分系统中两种激发波长下得到的喇曼原始谱图，另外一条有明显特征喇曼峰的谱图表示的是通过差分技术、BP神经网络技术以及去噪和解调算法等得到的有效特征谱图。

Figure 7.  Raman spectrogram of heroin

根据上述对几种弱激发样品下的喇曼特征的研究可以看出，传统的喇曼在检测这些物质时，由于有效喇曼特征峰被荧光背景淹没，从而得不到有用的物质信息，无法进行定性检测，对实际应用有着一定的困难。然而通过作者团队自主研发的差分喇曼系统，可以将被荧光淹没的物质特征峰提取出来，并且滤除有些与喇曼特征峰相似的尖锐峰，从而得到物质的有效喇曼特征谱图，对物质进行鉴别，以此解决行业中的应用难题。

阐述了一种荧光消除技术——位移差分喇曼光谱，这种技术基于在两个有轻微偏移的激发激光中收集两张不同的光谱，根据卡莎规则：当激发光频率移动时，喇曼光谱的荧光轮廓几乎不发生变化，喇曼特征峰会跟着移动，结合作者所在团队研发的BP神经网络技术, 可以准确分离差分信号和基线偏差，再运用团队开发的差分喇曼解调和去噪算法，从而有效地抑制荧光和其它干扰，提取出有效的物质喇曼特征谱图。其主要优点是：(1)与以前的技术对比，不需要使用特殊的设备来改变激励激光器的波长; (2)使用多通道检测，从而在给定的信号积分时间内改善了信噪比。除了这些特性以外，这种方法对于短寿命的和长寿命的荧光样品同样适用，可以很好地解决目前行业应用中检测时荧光背景强等干扰问题。并且由于目前传统喇曼不能定量，而差分喇曼可以抑制荧光基质等干扰，以后也许能够解决喇曼定量的问题，这将是未来研究的重要课题之一。